Giardia duodenum هڪ پرازياتي جاندار آهي جيڪو giardiasis جو سبب بڻجندو آهي، هڪ آنت جي انفيڪشن خاص طور تي عام طور تي ننڍن ٻارن ۾ دستن جي ڪلينڪ نشانين سان.اسان اڳ ۾ ٻڌايو آهي ته extracellular G. duodenalis intracellular oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) بائنڊنگ نيوڪليوٽائڊس کي چالو ڪري ٿو ۽ extracellular vesicle (EV) secretion ذريعي ميزبان سوزش واري ردعمل کي منظم ڪري ٿو.بهرحال، هن عمل ۾ شامل پيٿوجين سان لاڳاپيل ڊيوڊينوڪوڪل EV (GEV) جا صحيح سالم نمونا ۽ giardiasis ۾ NLRP3 inflammasome جو ڪردار واضح ٿيڻو آهي.
Recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardins GEV ۾ ٺاهيا ويا، ماؤس پرائمري peritoneal macrophages ۾ منتقل ڪيا ويا، ۽ سوزش جي ٽارگيٽ ماليڪيول ڪيسپيس-1 کي ماپڻ سان معلوم ڪيو ويو.p20 ايڪسپريس ليول جي اسڪريننگ ڪئي وئي..G. duodenalis alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardines اصل ۾ NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 and caspase-1 p20), IL secretion کي ماپڻ سان سڃاڻپ ڪئي وئي.1β سطحون، اپوپوٽڪ اسپاٽ ٿيل پروٽين (ASC) oligomerization جي سطح، ۽ NLRP3 ۽ ASC جي امونو فلوروسنٽ لوڪلائيزيشن.G. duodenalis جي pathogenicity ۾ NLRP3 inflammasome جو ڪردار پوءِ چوٿون استعمال ڪندي جائزو ورتو ويو جنھن ۾ NLRP3 ايڪٽيويشن بلاڪ ڪيو ويو (NLRP3 بلاڪ ٿيل چوٿون) ۽ جسم جي وزن ۾ pathological تبديليون، duodenal parasitic load، ۽ duodenal tissue جي نگراني ڪئي وئي.ان کان علاوه، اسان تحقيق ڪئي ته ڇا hiardines alpha-2 ۽ alpha-7.3 vivo ۾ IL-1β secretion کي NLRP3 inflammasome ذريعي داخل ڪن ٿا ۽ انهن ماليڪيولز جي ڪردار کي چوٿن ۾ G. duodenalis جي pathogenicity ۾ طئي ڪيو.
Alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardines ويٽرو ۾ NLRP3 جي سوزش کي چالو ڪري ٿو.اهو p20 caspase-1 جي چالو ٿيڻ جو سبب بڻيو، NLRP3، پرو-IL-1β، ۽ پرو-ڪيسپيس-1 پروٽين جي اظهار جي سطح ۾ اضافو، IL-1β secretion ۾ هڪ اهم اضافو، ASA اسپاٽ جي ٺهڻ. cytoplasm، ۽ ASA oligomerization جي شموليت.NLRP3 جي سوزش قلمي نقصان چوٿن ۾ G. duodenalis جي pathogenicity کي وڌائي ٿو.NLRP3-بلاڪ ٿيل چوهڙن جي گيواج ذريعي سسٽن سان علاج ڪيل چوهاڻن ٽرفوزائٽس جي وڌندڙ تعداد جي نمائش ڪئي ۽ ڊوڊينل ويلي کي سخت نقصان پهچايو، جنهن جي خاصيت necrotic crypts سان گڏ سڪي وڃڻ ۽ شاخ ڪرڻ سان.vivo تجربن ۾ ڏيکاريو ويو آهي ته giardines alpha-2 ۽ alpha-7.3 IL-1β جي secretion کي NLRP3 inflammasome ذريعي ڪري سگھن ٿا، ۽ giardines alpha-2 ۽ alpha-7.3 سان اميونائيزيشن کي چوٿين ۾ G. duodenalis جي pathogenicity گھٽائي ٿي.
گڏ ڪيل، هن مطالعي جي نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته giardia alpha-2 ۽ alpha-7.3 ميزبان NLRP3 جي سوزش کي وڌايو ۽ چوٿين ۾ G. duodenalis جي انفيڪشن کي گھٽائي ٿو، جيڪي giardiasis کي روڪڻ لاء واعدو هدف آهن.
Giardia duodenum هڪ extracellular protozoan parasite آهي جيڪو ننڍي آنت ۾ رهندو آهي ۽ giardiasis جي 280 ملين ڪيسن جو سبب بڻجندو آهي هر سال دستن سان گڏ، خاص طور تي ترقي پذير ملڪن ۾ ننڍن ٻارن ۾ [1].ماڻهو پيئڻ جو پاڻي يا کاڌو کائڻ سان ان ۾ مبتلا ٿي ويندا آهن M. duodenum cysts، جيڪي پوءِ معدي ۾ داخل ٿين ٿا ۽ گيسٽرڪ جوس ۾ خارج ٿين ٿا.Giardia duodenum trophozoites duodenal epithelium سان ڳنڍجن ٿا، جن جي ڪري الٽي، الٽي، اسهال، پيٽ ۾ درد ۽ وزن گھٽجي ٿو.Immunodeficiency ۽ سسٽڪ فائبروسس وارا فرد انفيڪشن لاءِ حساس هوندا آهن.انفڪشن زباني ۽ مقعد جي جنسي ذريعي پڻ ٿي سگهي ٿي [2].دوائون جهڙوڪ ميٽرونيڊازول، ٽينيڊازول، ۽ نائيٽازڪسانائيڊ، دوائن جي انفيڪشن لاءِ ترجيحي علاج جا اختيار آهن [3].جڏهن ته، اهي ڪيموٿراپي منشيات جي خراب ضمني اثرات جو سبب بڻجن ٿيون جهڙوڪ متلي، ڪارڪينوجنسي، ۽ جينوٽڪسائيٽي [4].تنهن ڪري، G. duodenalis انفيڪشن کي روڪڻ لاءِ وڌيڪ اثرائتي حڪمت عمليون تيار ڪرڻ گهرجن.
Inflammasomes cytosolic پروٽين ڪمپليڪس جو ھڪڙو طبقو آھي جيڪي پيدائشي مدافعتي ردعمل جو حصو آھن، پيٿوجين جي حملي جي خلاف دفاع ڪرڻ ۾ مدد ڪن ٿا ۽ سوزش واري ردعمل کي وچولي ڪن ٿا [5].انهن inflammasomes جي وچ ۾، nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome وڏي پيماني تي اڀياس ڪيو ويو آهي ڇاڪاڻ ته ان کي ڳولي سگهجي ٿو مختلف pathogen/binding oligomerization (molepascular pattern) DAMP) کي سڃاڻي ٿو، فطري مدافعتي نظام کي چالو ڪري ٿو.۽ ڪيترن ئي سوزش واري بيمارين ۾ آنت جي هوميوسٽاسس کي منظم ڪري ٿو [6,7,8].اهو نمونن جي سڃاڻپ ريڪٽر (PRR) NLRP3 تي مشتمل آهي، هڪ اڊاپٽر اپوپٽوٽڪ اسپاٽ ٿيل پروٽين (ASC)، ۽ هڪ اثر ڪندڙ procaspase-1 يا procaspase-11.NLRP3 inflammasome pathogen invasion جي خلاف هڪ ميزبان طور ڪم ڪري ٿو، جيئن Neospora caninum [9]، Paracoccidioides brasiliensis [10]، ۽ Leishmania مطالعي ۾ ڏٺو ويو آهي.[11]، پر اهو پڻ ٻڌايو ويو آهي ته NLRP3 سوزش جي چالو حفاظتي مدافعتي ردعمل کي محدود ڪري ٿو ۽ بيماري جي ترقي کي وڌائي ٿو، مثال طور، ڪيڙن ۾ [12].اسان جي پوئين نتيجن جي بنياد تي، اسان ٻڌايو ته extracellular G. duodenalis NLRP3 جي سوزش جي intracellular چالو ڪري ٿو ۽ extracellular vesicles (EVs) کي ڳجهو ڪندي ميزبان سوزش واري ردعمل کي ماڊل ڪري ٿو [13].بهرحال، ويوو ۾ G. duodenalis انفيڪشن ۾ NLRP3 سوزش جو ڪردار طئي ٿيڻو آهي.
Giardins اصل ۾ G. duodenalis cytoskeleton جي ساخت جي اجزاء طور بيان ڪيا ويا آهن ۽ ننڍي آنت ۾ trophozoite جي متحرڪ ۽ epithelial cell جي جڙيل ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا.ماحول کي بهتر نموني سان ٺهڪائڻ ۽ انهن جي روڪٿام کي وڌائڻ لاء، G. duodenalis trophozoites هڪ منفرد cytoskeletal ڍانچي ٺاهيا جنهن ۾ 8 flagella، 1 وچين جسم، ۽ 1 ventral disc [14].Giardia duodenum جا trophozoites پنھنجي cytoskeleton کي استعمال ڪن ٿا مٿئين ننڍي آنڊن ۾ گھڙڻ لاءِ، خاص ڪري duodenum ۾، ۽ enterocytes سان ڳنڍڻ لاءِ.اهي مسلسل لڏپلاڻ ڪن ٿا ۽ سيل ميٽابولزم کي استعمال ڪندي ايپيٿيليل سيلز سان ڳنڍيل آهن.تنهن ڪري، انهن جي cytoskeleton ۽ virulence جي وچ ۾ هڪ ويجهي تعلق آهي.Giardines مخصوص Giardia duodenum لاءِ آهن سيٽوسڪيليٽن جي جوڙجڪ جا جزا [15] ۽ چئن طبقن ۾ ورهايل آهن: α-، β-، γ-، ۽ δ-giardines.α-giardin خاندان جا 21 ميمبر آهن، جن مان سڀني کي فاسفولپائڊس کي پابند ڪرڻ جي ڪلسيم-انحصار جي صلاحيت آهي [16].اهي پڻ cytoskeleton کي سيل جھلي سان ڳنڍيندا آهن.G. duodenalis جي ڪري دستن ۾ مبتلا ماڻهن ۾، α-giardins انفيڪشن جي دوران انتهائي ظاهر ۽ مدافعتي هوندا آهن [17].Giardia alfa-1 جي بنياد تي هيٽرولوگس ويڪسينز چوٿن ۾ giardiasis جي خلاف محفوظ آهن ۽ ويڪسين جي ترقي لاء امڪاني اميدوار اينٽيجنز آهن [18].Alpha-8 giardin، پلازما جھلي ۽ flagella ۾ مقامي، پر ventral ڊسڪ ۾ نه، G. duodenalis ۾ trophozoites جي حرڪت ۽ واڌ جي شرح کي وڌائي ٿو [19].Alpha-14 giardin flagella تي microtubule ڍانچي سان ڳنڍيندو آهي ۽ G. duodenalis [20] جي عملداري کي متاثر ڪري ٿو.Alpha-11 giardine وڏي مقدار ۾ سڄي زندگي جي چڪر ۾ موجود آهي، ۽ Alpha-11 giardine جي اوور ايڪسپريشن خود G. duodenalis کي نقصان پهچائي ٿي [21].بهرحال، اهو واضح ناهي ته ڇا الفا-2 گارڊائن ۽ الفا-7.3 گارڊائن G. duodenalis انفيڪشن ۽ انهن جي بنيادي ميڪانيزم جي خلاف حفاظتي آهن.
ھن مطالعي ۾، recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine کي مائوس پرائمري peritoneal macrophages ۾ تبديل ڪيو ويو ھوسٽ NLRP3 کي چالو ڪرڻ لاءِ.ان کان پوءِ سوزش واري هدفن جي چڪاس ڪئي وئي.اسان G. duodenalis جي pathogenicity ۾ NLRP3 inflammasome جي ڪردار جو پڻ جائزو ورتو، تحقيق ڪئي ته ڇا الفا-2 ۽ الفا-7,3 giardines vivo ۾ NLRP3 inflammasome کي چالو ڪن ٿا، ۽ اهو طئي ڪيو ويو ته giardines جا اهي ٻه ڪردار روجن جي بيماري ۾. جي دوڊيناليساسان جو گڏيل مقصد G. duodenalis انفيڪشن جي روڪٿام لاءِ واعدو ڪندڙ هدفن کي ترقي ڪرڻ هو.
وائلڊ ٽائيپ (WT) C57BL/6 5-8 هفتا جي ڄمار واري عورت چوهاڻ Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China) کان خريد ڪيا ويا.چوڪن کي پاڻي تائين مفت رسائي هئي، جراثيم کان پاڪ کاڌو حاصل ڪيو ويو ۽ 12/12 ڪلاڪ روشني / اونداهي چڪر ۾ رکيو ويو.انفڪشن کان اڳ، چوڪن کي پيئڻ جي پاڻيءَ ۾ اينٽي بايوٽيڪس ايڊ ليبٽم ملي ٿي جنهن ۾ امپيسلن (1 mg/mL)، vancomycin (1 mg/mL)، ۽ neomycin (1.4 mg/mL) (سڀ خريد ڪيا ويا شنگھائي، چين، مصنوعي جاندارن) [22] ].].چوٿون جيڪي 24 ڪلاڪن کان کائڻ ۽ پيئڻ جي صلاحيت وڃائي ويٺا هئا ۽ ≥ 20% جسماني وزن وڃائي چڪا هئا انساني طور تي سروائيڪل ڊسلوڪشن جي ڪري euthanized هئا.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) کي 12.5% ​​fetal bovine serum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) ۽ 0.1% bovine bile (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) سان پورو ڪيو ويو. ).آمريڪا) مائڪرو ايروبڪ حالتن هيٺ.سنگم ٽرفوزائٽس برف تي گڏ ڪيا ويا ۽ 1:4 جي تناسب سان گذري ويا وڌيڪ پيدائش لاءِ.
Giardia duodenum cysts induced ڪيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [23]، trophozoites logarithmic مرحلي ۾ حاصل ڪيا ويا ۽ پوءِ encapsulation inducing medium، pH 7.1 (تبديل ٿيل TYI-S-33) سان 1 × 106 ٽرفوزائٽس جي آخري ڪنسنٽريشن تائين گھٽيا ويا.بائل ڪنسنٽريشن 0.05٪ وچولي).ٽروفوزائٽس 37 ° C تي anaerobic حالتن هيٺ ڪلچر ڪيو ويو جيستائين لاگارٿمڪ ترقي واري مرحلي تائين.ميڊيم کي سسٽ انڊيڪسنگ ميڊيم ۾ تبديل ڪريو (pH 7.8؛ تبديل ٿيل TYI-S-33 ميڊيم 1٪ بائل ڪنسنٽريشن سان) ۽ ڪلچر G. duodenalis 37°C تي 48-96 ڪلاڪن لاءِ، جنهن دوران سيسٽن جي ٺهڻ کي خوردبيني هيٺ ڏٺو ويو.گھڻا ٽرافيوزائٽس کي سيسٽ بڻائڻ لاءِ حوصلا افزائي ڪرڻ کان پوءِ، ڪلچر جي ميلاپ کي گڏ ڪيو ويو ۽ باقي ٽرافيوزائٽس کي لڪائڻ لاءِ جراثيم کان پاڪ پاڻيءَ ۾ ٻيهر اڇلايو ويو.سيسٽن کي ڳڻيو ويو ۽ 4 ° سي تي ذخيرو ڪيو ويو ايندڙ تجزين لاءِ چوٿين ۾ گيسٽرڪ ٽيوب ذريعي.
Giardia extracellular vesicles (GEVs) کي وڌايو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو [13].Logarithmic واڌ جي مرحلي ۾ ٽرفوزائٽس کي تبديل ٿيل TYI-S-33 وچولي ۾ بحال ڪيو ويو جيڪو Exosome-depleted FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) سان تيار ڪيو ويو 1 × 106 parasites/mL جي آخري ڪنسنٽريشن تائين ۽ 12 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو.2000 گرام 10 منٽ، 10,000 گرام 45 منٽ، ۽ 60 منٽ لاءِ 100,000 گرام سينٽرفيوگريشن ذريعي ڪلچر سپرنيٽنٽ کان ڌار ڪيو ويو.فاسفيٽ بفر ٿيل لوڻ (PBS) ۾ پريپيپيٽيٽس کي ٽوڙيو ويو، BCA پروٽين اسي ڪٽ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) استعمال ڪندي مقدار کي مقرر ڪيو ويو ۽ -80 ° C. تي محفوظ ڪيو ويو يا وڌيڪ تجزيي لاءِ سڌو استعمال ڪيو ويو.
پرائمري ماؤس peritoneal macrophages تيار ڪيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [24].مختصر طور، چوٿين (6-8 هفتا جي عمر) کي 2.5 ml جي 2.98٪ Difco liquid thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) سان انجيڪشن (intraperitoneally [ip]) ڪيو ويو ۽ 3-4 تالو کي کارايو ويو.euthanasia کان پوء چوٿين جي پيٽ جي گفا مان macrophages جو هڪ معطلي گڏ ڪيو ويو ۽ 10 منٽ لاء 1000 گرام تي 3 ڀيرا سينٽرفيوج ڪيو ويو.حاصل ڪيل سيلز فلو سائٽوميٽري ذريعي CD11b مارڪر استعمال ڪندي ڳوليا ويا جيستائين سيل جي پاڪيزگي>98٪ هئي، پوءِ 6-well سيل ڪلچر پليٽس ۾ شامل ڪيو ويو (4.5 x 106 سيلز/ڪل) ۽ 10٪ FBS (BioIndustry) سان 37 ° C تي incubated.۽ 5٪ CO2.
TRIzol reagent (Vazyme, Nanjing, China) جي 1 ml ۾ 1 × 107 trophozoites مان آر اين اي ڪڍيو ويو، جينومڪ ڊي اين اي ڪل G. duodenalis RNA مان ڪڍيو ويو MonScript dsDNase (موناد، ووهان، چين) ۽ مڪمل ڊي اين اي (مطابقت) ڪيو ويو. ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق MonScript RTIIII Super Mix (Monad) استعمال ڪندي.
ٽارگيٽ G. duodenalis جين لاءِ سي ڊي ايس جي ترتيب جي معلومات NCBI GenBank مان حاصل ڪئي وئي.استعمال ڪريو پرائمر 5.0 هر ٽارگيٽ جين لاءِ مخصوص بيحد ڪلوننگ پرائمر ڊزائين ڪرڻ لاءِ.فارورڊ پرائمر (5′-3′) ٽن حصن تي مشتمل آهي: هڪ اوورليپنگ sequence with a linearized vector pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) ۽ ڪوڊون ATG ۽ GNN شروع ڪريو (جيڪڏهن پهريون بنياد G نه آهي).اهو اظهار جي ڪارڪردگي کي بهتر ڪرڻ لاء ڪيو ويو آهي.ان کان علاوه، گھٽ ۾ گھٽ 16 bp گڏيل بيس (GC مواد 40-60%/Tm تقريباً 55 °C).ريورس پرائمر (5′-3′) ٻن حصن تي مشتمل آهي، هڪ اوورليپنگ تسلسل EcoRV-linearized vector pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) سان گڏ ۽ گهٽ ۾ گهٽ 16 bp جو گڏيل بنياد.(آخري ٻن اسٽاپن کانسواءِ).بيسز) هڪ ڪوڊون جهڙوڪ AA يا GA کي اجازت ڏيڻ جي اجازت ڏيڻ لاءِ recombinant پلازميڊ کي انهن جي ليبل ٿيل پروٽين کي ظاهر ڪرڻ لاءِ).پرائمر ترتيبون جدول 1 ۾ درج ٿيل آھن ۽ ڪانگميٽ بايو ٽيڪنالاجي ڪمپني لميٽيڊ (چانگچون، چين) پاران ٺھيل آھن.
Pfu DNA پوليمريز (Tiangen, Beijing, China) يا Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) استعمال ڪندي ھدف کي وڌايو ويو G. duodenalis cDNA کي ٽيمپليٽ طور استعمال ڪندي.eukaryotic ايڪسپريشن ویکٹر پلازميڊ pcDNA3.1(+) کي پابندي اينزيم EcoRV سان لڪيرايو ويو ۽ فاسٽ اي پي (ٿرمو فشر سائنسي) استعمال ڪندي ڊيفاسفوريليٽ ڪيو ويو.لڪيرايل pcDNA3.1(+) ٽڪرا ۽ وڌايل ٽارگيٽ جين جا ٽڪرا DNA جيل صاف ڪرڻ واري کٽ (Tiangen) استعمال ڪندي صاف ڪيا ويا ۽ Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) استعمال ڪندي مقدار کي درست ڪيو ويو.pcDNA3.1(+) ٽڪرا ۽ هر ٽارگيٽ جين جو ٽڪرو MonClone سنگل اسمبلي ڪلوننگ ميڪس (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) استعمال ڪندي ٻيهر جوڙيو ويو ۽ Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) استعمال ڪندي ڊي اين اي جي ترتيب سان تصديق ڪئي وئي..
Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ٺاهيا ويا SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) استعمال ڪندي.ڪنسنٽريشن 500 ng/µl کان مٿي برقرار رکيو ويو ان ڳالهه کي يقيني بڻائڻ لاءِ ته ايليوشن بفر ۾ EDTA منتقلي جي امتحان ۾ مداخلت نه ڪئي.پرائمري ماؤس جي پيريٽونيل ميڪروفيجز کي 6 چڱين پليٽن ۾ 12 ڪلاڪن تائين مڪمل RPMI 1640 ميڊيم (بيولوجيڪل انڊسٽريز) سان ڪلچر ڪيو ويو، ان کان پوءِ سيلن کي گرم PBS ۾ 3 ڀيرا ڌويو ويو ته جيئن پينسلين ۽ اسٽريپٽومائسن کي هٽايو وڃي، ۽ پوءِ وچولي ۾ مڪمل ميڊيم سان گڏ ڪيو ويو.Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) 125 μl Opti-MEM گھٽجي سيرم ميڊيم (Gibco، Thermo Fisher Scientific) ۾ ملائي ويا..پوءِ 5 µl Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) کي گھٽ سيرم Opti-MEM ميڊيم جي 125 µl ۾ ملائي ڇڏيو ويو.ليپوسوم-ڊي اين اي ڪمپليڪس تيار ڪريو لئپوفيڪٽامين 2000 سان ٺهڪندڙ اينڊوٽوڪسين فري پلاسميڊ کي ملايو ۽ مرکب کي 5 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي بيهڻ جي اجازت ڏيو.ڪمپليڪس کي الڳ الڳ سيلز ۾ منتقل ڪريو هر کوهه ۾ ۽ آهستي آهستي ملايو.4 ڪلاڪن کان پوء، سيل ڪلچر وچولي کي 2 ml مڪمل RPMI 1640 ميڊيم سان تبديل ڪيو ويو ۽ ڪلچر کي 24 ڪلاڪن تائين جاري رکيو ويو.تازو سيل ڪلچر وچولي سيلز ۾ شامل ڪيو ويو ۽ مختلف وقت جي پوائنٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو ان جي بنياد تي پرکھ جي ڊيزائن.
پروٽينن جا نمونا سپرنٽنٽس ۽ سيل ليسيٽس مان تيار ڪيا ويا جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [25].پرو-IL-1β، پرو-ڪيسپيس-1، ڪئسپيس-1 p20، NLRP3، β-actin، ۽ سندس-ٽيگ لاءِ جھلي جي منتقلي جا پيرا ميٽر 200 mA/90 منٽ هئا.Interleukin 1β (IL-1β؛ R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) and NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) ۽ 1:5000 ھدف ڪرڻ لاءِ سندس ٽيگ (Amylet Scientific) ووهان، چين) ۽ β-ايڪٽين (پروٽينٽيڪ، ووهان، چين).
Disuccinimide suberate (DSS) سان ڪراس لنڪنگ ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي [26].سيلز کي 3 ڀيرا ٿڌو پي بي ايس سان ڌويو ويو ۽ مڪمل طور تي 50 μl ASC ردعمل بفر (pH 8.0) ۾ 27 گيج سوئي سان ڌوئي ويو، جنهن ۾ 25 mM Na2PO4، 187.5 mM NaCl، 25 mM HEPES ۽ 125 mM NaHCO3 شامل آهن.مرکب 5000 g تي 3 منٽ لاءِ سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ گولي کي 10 μl DSS (DMSO ۾ 25 mM) ۽ 40 μl ASC رد عمل بفر سان 30 منٽ لاءِ 37 ° C تي سيو ڪيو ويو.10 منٽ لاءِ 5000 g تي سينٽرفيوگريشن کان پوءِ، گولي کي 40 µl ASC ردعمل بفر جي حل ۾ ۽ 10 µl 6x پروٽين لوڊ ڪرڻ واري بفر (ٽرانس جين، بيجنگ، چين) جي حل ۾ حل ڪيو ويو، ۽ پوءِ ان حل کي 15 تائين ڪمري جي گرمي پد تي وسايو ويو. منٽ، پوءِ 10 منٽ اڇو.پروٽين جا نمونا پوءِ مغربي بلڊنگ جي تابع ڪيا ويا پرائمري اينٽي اي ايس سي اينٽي باڊيز (وانليبيو، شينيانگ، چين) کي 1:500 جي گھٽتائي واري تناسب تي استعمال ڪندي.
اڳئين بيان ڪيل طريقي جي پٺيان [13]، سيل ڪلچر سپرنٽنٽس حاصل ڪيا ويا ۽ پرو سوزش واري سائٽوڪائن IL-1β جي secretion کي ماؤس IL-1 بيٽا ELISA ڪٽ (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو.OD450nm قدرن کي IL-1β معياري وکر استعمال ڪندي پروٽين جي ڪنسنٽريشن ۾ تبديل ڪريو.
ڪپڙا ڍڪيل سيلز کي 3 ڀيرا گرم PBS ۾ ڌوئي ويو، ٽشو سيل فيڪسيوٽ (Biosharp، Beijing، China) ۾ 10 منٽ لاءِ ڪمري جي حرارت تي (RT)، 0.1% Triton X-Permeabilize ۾ 100 (PBS ۾ ٺھيل؛ Biosharp) ) 20 منٽن لاء ڪمري جي حرارت تي ۽ 5٪ بوائن سيرم البمين ۾ بلاڪ ڪريو (PBS ۾) 2 ڪلاڪن لاء ڪمري جي حرارت تي.سيلن کي پوءِ رات جو 4 ڊگري سينٽي گريڊ تي پرائمري اينٽي باڊيز سان ASC (1:100 dilution) يا NLRP3 (1:100 dilution) جي خلاف ترتيب ڏني وئي، ۽ Cy3 ليبل ٿيل بکري مخالف خرگوش IgG(H+L) (1:400؛ EarthOx) , San Francisco, CA, USA) يا FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (1:400; Earthox) رات جو 37 ° C تي اونداهي ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ.نيوڪلي کي Hoechst 33258 (10 μg/ml؛ UE، Suzhou، China) سان 5 منٽن لاءِ داغ ڪيو ويو ۽ فلورسنس خوردبيني (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) هيٺ مشاهدو ڪيو ويو.
چوٿين گروپن ۾ ورهايل هئا (n = 7 هر گروپ ۾): (i) PBS-علاج ٿيل منفي ڪنٽرول گروپ (صرف PBS؛ gavage 100 µl/mouse PBS بعد ۾ روزاني intraperitoneal انجيڪشن 100 µl/mouse PBS 3 ڪلاڪ بعد).مسلسل 7 ڏينهن تائين؛(ii) منفي ڪنٽرول گروپ MCC950 inhibitor سان علاج ڪيو ويو [27] (100 µl/مائوس ذريعي PBS gavage، 3 ڪلاڪ بعد، 10 mg/kg جسماني وزن [BW] MCC950 [PBS ۾] روزاني اندروني طور تي منظم ڪيو ويو، مدت 7 ڏينهن؛(iii) G. duodenalis cyst انفيڪشن گروپ (1.5 x 106 cysts/mouse by gavage، 3 ڪلاڪ بعد، 100 μl/mouse PBS intraperitoneally 7 ڏينهن لاءِ روزانو استعمال ڪيو ويو)؛(iv) G. duodenalis cyst گڏيل انفيڪشن گروپ MCC950 inhibitor علاج گروپ (1.5×106 cysts/mouse via gavage, 10mg/kg body weight MCC950 intraperitoneally 7 ڏينهن 3h تي روزانو).هر مائوس جي جسم جي وزن کي روزانو مانيٽر ڪيو ويو ۽ سڀني چوٿين کي 7 هين ڏينهن euthanized ڪيو ويو.کٽيل ڊيوڊنم (3 سينٽي ڊگهو) کي 1 ml PBS ۾ ننڍڙن ٽڪرن ۾ ڪٽيو ويو، سيسٽن کي PBS ۾ 4°C تي رات جو تباهه ڪيو ويو، ۽ G. duodenalis trophozoites.تازو duodenum (1 سينٽي ڊگهو) hematoxylin ۽ eosin (H&E) داغ لاءِ ڌار ڪيو ويو.
چوٿين ٻن گروپن ۾ ورهايل هئا: (i) MOCK ڪنٽرول گروپ ۽ (ii) MCC950 روڪيندڙ گروپ.هر گروپ ۾ پنج علاج هئا (n = 7/علاج گروپ): (i) PBS علاج منفي ڪنٽرول گروپ (صرف PBS؛ 100 μl / ماؤس PBS، intramuscular (IM) انجيڪشن (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1 (+) پلازميڊ ناڪاري ڪنٽرول گروپ (100 µg/مائوس ڊي اين اي، انٽرماسڪولر انجيڪشن ذريعي)؛ (iii) G. duodenalis cyst انفيڪشن مثبت ڪنٽرول گروپ (1.5 x 106 cysts/mouse, through gavage) (iv) a گروپ جو علاج ڪيو ويو پلازميڊ pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/مائوس ڊي اين اي، انٽرماسڪولر انجيڪشن ذريعي)، ۽ (v) هڪ گروپ جو علاج ٿيل پلازميڊ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/مائوس) سان ڊي اين اي، 12 ڪلاڪن جي گذرڻ کان پوءِ، MCC950 inhibitor گروپ جي چوڪن کي 7 ڏينهن تائين MCC950 (10 mg/kg جسماني وزن) جو روزاني intraperitoneal انجيڪشن ملي ٿي، جڏهن ته MOCK گروپ جي چوٿين کي PBS جي علاج جي برابر مقدار ۾ رت جا نمونا مليا. اکين جي چوڪن مان گڏ ڪيو ويو ۽ 4 ° C تي رات جو ڇڏي ويو سيرم جي نموني کي IL-1β جي سطح جي ماپ لاء اينزيم سان ڳنڍيل اميونوسوربينٽ پرس (ELISA) استعمال ڪندي.
پنجن چوڪن کي پنجن گروپن ۾ ورهايو ويو (n = 7 / گروپ).گروپ 1 ھڪڙو منفي ڪنٽرول گروپ ھو جيڪو پي بي بي سان علاج ڪيو ويو: چوٿين پي بي بي جي 100 μl intramuscularly ۽ 3 ڏينھن بعد گيوج ذريعي حاصل ڪئي.گروپ 2 هڪ مثبت ڪنٽرول گروپ آهي جيڪو G. duodenalis cysts سان متاثر ٿيل آهي: چوڪن کي 100 μl PBS سان انجيڪشن ڪيو ويو، ۽ 3 ڏينهن بعد 1.5 x 106 cysts/mouse intragastrically injected.ٽيون گروپ - pcDNA3.1(+) سان گڏ پلاسميڊ اميونائيزيشن ۾ هڪ ڪنٽرول گروپ سان گڏ ڊوڊينل سسٽ انفڪشن لاءِ: چوٿون مليا 100 μg پلاسميڊ ڊي اين اي pcDNA3.1(+)(im) زباني طور تي، 1.5×106 cysts/mouse 3 ڪيترن ئي لاءِ ڏينهن.گروپن 4 ۽ 5 ۾ PcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid يا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid recombinant هئا G. duodenalis cyst infection سان گڏ.تجرباتي گروپ: چوٿون 100 µg pcDNA3 مليا.1(+)-giardine plasmid DNA (im)، پوءِ 3 ڏينهن بعد، 1.5 × 106 cysts/mouse gavage ذريعي داخل ڪيا ويا.ٽيوب ذريعي G. duodenalis cyst جي تعارف کان پوءِ هر مائوس جي جسماني وزن جي نگراني ڪئي وئي.تازو دوڊينم گڏ ڪيو ويو parasitic لوڊ جي ماپ ۽ HE staining تجزيو لاء.
هسٽوپيٿولوجي تبديلين جو تجزيو ڪيو ويو اڳ شايع ٿيل طريقيڪار جي مطابق [30].تازو ڊيوڊنم کي ٽشو سيل فيڪسيوٽ سان لڳايو ويو، پيرافين ۾ شامل ڪيو ويو، 4 μm حصن ۾ ڪٽيو ويو، H&E سان داغ ٿيل ۽ روشني خوردبيني جي تحت تجزيو ڪيو ويو.ستن آزاد چوڪن مان ستن ٽشو حصن ۾ نمائندن جي پيٽولوجي تبديلين جو جائزو ورتو ويو هڪ پيٽولوجسٽ طرفان علاج کان بي خبر ۽ 200x ميگنيفڪيشن تي قبضو ڪيو ويو.villi جي ڊيگهه ۽ crypts جي کوٽائي اڳ ۾ بيان ڪيل طريقن جي مطابق ماپ ڪئي وئي.
vitro ۽ vivo ۾ نتيجا حاصل ڪيا ويا triplicate ۾.GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) استعمال ڪندي گراف ٺاهيا ويا.ٻن گروپن جي وچ ۾ فرق ٽي-ٽيسٽ ذريعي تجزيو ڪيو ويو، جڏهن ته ≥3 گروپن جي وچ ۾ فرق SPSS سافٽ ويئر (نسخ 22.0؛ SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) استعمال ڪندي مختلف قسم جي هڪ طرفي تجزيي (ANOVA) ذريعي تجزيو ڪيو ويو.ڊيٽا جو تجزيو ڪيو ويو تفاوت جي هڪجهڙائي لاءِ ليوين جي ٽيسٽ استعمال ڪندي بعد ۾ بونفيروني جي پوسٽ هاڪ ٽيسٽ (B).اھميت بيان ڪئي وئي آھي P <0.05، P <0.01، ۽ P <0.001 (ناھي اهم [ns]) (P> 0.05).
ڪيوٽو انسائيڪلوپيڊيا آف جينس ۽ جينومس (KEGG) ۾ GEV پروٽومڪس جي اسان جي پوئين تجزيي ڏيکاري ٿي ته ڪيترن ئي هدفن کي سوزش واري سگنلنگ رستن جي چالو ڪرڻ ۾ شامل ٿي سگھي ٿو [13].اسان ٻن اميدن جا هدف چونڊيا آهن، الفا-2 ۽ الفا-7.3 گيارڊين، انهن ماليڪيولن کي وڌايو ۽ انهن کي استعمال ڪيو pcDNA3.1(+) يوڪريوٽڪ ايڪسپريشن ويڪٽر ٺاهڻ لاءِ.ترتيب ڏيڻ کان پوء، recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardine expression plasmids کي بنيادي ماؤس peritoneal macrophages ۾ تبديل ڪيو ويو، ۽ سوزش جي caspase-1 p20 دستخط پروٽين (فعال ڪيل ڪيسپيس-1 جو هڪ ٽڪرو) جي سڃاڻپ ڪئي وئي. جيئن ته اهم ماليڪيولز کي واضح ڪري ٿو جيڪو سوزش کي متحرڪ ڪري سگهي ٿو.نتيجن مان ظاهر ٿيو ته الفا-2 ۽ الفا-7.3 گارڊائنس P20 ڪئسپيس-1 اظهار کي GEV سان ملندڙ جلندڙ ڪري سگھن ٿا.ڪيسپيس-1 چالو ڪرڻ تي ڪو اثر نه مليو غير علاج ٿيل منفي ڪنٽرول (صرف پي بي بي) ۽ پلازميڊ ڪنٽرول pcDNA3.1 (+) (شڪل 1).
pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardins پاران p20 caspase-1 چالو ڪرڻ جي ماپ.recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardines (هر لين جي مٿان) پرائمري ماؤس peritoneal macrophages ۾ منتقل ڪيا ويا ۽ ڪلچر سپرنيٽنٽ 24 ڪلاڪن بعد حاصل ڪيا ويا.مغربي بلٽنگ استعمال ڪيو ويو اظهار جي سطح کي ماپڻ لاءِ دستخط ڪيسپيس-1 p20 سوزش واري پروٽين.PBS-صرف علاج گروپ (لين سي) ۽ pcDNA3.1 (+) مونوٿراپي گروپ (pcDNA3.1 لين) استعمال ڪيا ويا منفي ڪنٽرول طور، ۽ GEV علاج گروپ کي مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو.هر پروٽين ۾ هسٽيڊائن ٽيگ کي ڳولڻ سان ٻيهر ٺهڪندڙ پروٽين جي اظهار جي تصديق ڪئي وئي، ۽ متوقع پروٽين بينڊ الفا-2 گارڊائن (38.2 kDa) ۽ الفا-7.3 giardine (37.2 kDa) هئا.GEV، Giardia duodenum extracellular vesicles، pcDNA3.1(+)، EcoRV-linearized vector، SUP، supernatant
اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا alpha-2 giardine ۽ alpha-7.3 giardine induce p20 caspase-1 اظهار ۽ ميزبان NLRP3 سوزش واري ردعمل کي چالو ڪرڻ ۾ ڪردار ادا ڪن ٿا، pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ۽ pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin recombinant plasmid DNA سان پرائمري ماؤس peritoneal macrophages ۾ منتقل ڪيو ويو، ۽ اهم سوزش واري پروٽين جي اظهار، لوڪلائيزيشن، ۽ oligomerization جي سطحن کي طئي ڪيو ويو NLRP3.ھن تجربي ۾، GEV استعمال ڪيو ويو مثبت ڪنٽرول گروپ، ۽ ڪو علاج گروپ (صرف PBS) يا pcDNA3.1 (+) منتقلي علاج گروپ منفي گروپ ھو.نتيجن مان ظاهر ٿيو ته، GEV گروپ ۾، giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 ۽ giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جي recombinant plasmid DNA جي نتيجي ۾ NLRP3، پرو-IL-1β ۽ procaspase-1 ۽ caspase-1 ايڪٽيوشن (تصوير 2a).ان کان علاوه، ٻنهي giardines ill-1β secretion (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.007 ).؛alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.0047) (شڪل 2b).اڪثر ASC پروٽين غير علاج واري گروپ ۾ يا علاج واري گروپ ۾ پي سي ڊي اين اي 3.1 (+) پلازميڊ سان منتقل ٿيل مونوميرڪ هئا، ان جي ابتڙ pcDNA3.1(+)-alpha-2 يا pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 گارڊائن.ASC oligomerization GEV مثبت ڪنٽرول گروپ يا گروپ جي ٻيهر ٺهڪندڙ پلاسميڊ ڊي اين اي ۾ واقع ٿي، هڪ oligomeric فارم ڏيکاريندي (شڪل 2c).اهي ابتدائي ڊيٽا پيش ڪن ٿا ته الفا-2 گارڊائن ۽ الفا-7,3 گارڊائن NLRP3 سوزش چالو ڪري سگھن ٿا.بعد ۾ ASC ۽ NLRP3 جي لوڪلائيزيشن جي امونو فلوروسينٽ مطالعي مان ظاهر ٿيو ته منفي ڪنٽرول گروپ ۾، ASC پروٽين سڄي سائٽوپلازم ۾ پکڙيل هئي ۽ giardine يا pcDNA3 سان pcDNA3.1(+)-alpha-2 جي محرک تي ڊٽ سگنل جي طور تي ظاهر ٿيو.1(+)-alpha-7,3 giardine گروپ يا GEV مثبت ڪنٽرول گروپ (شڪل 2d).ناڪاري ڪنٽرول ۽ پلازميڊ-علاج ٿيل pcDNA 3.1 گروپن ۾، NLRP3 پروٽين سگنل معلوم نه ڪيو ويو، جڏهن ته pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine يا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جي جواب ۾ هڪ فلورسنٽ سگنل ڊٽ. معلوم ڪيو ويو..giardine cytoplasm ۾ يا HEV جي محرک تي مليا آهن (تصوير 2e).اهي ڊيٽا وڌيڪ ظاهر ڪن ٿا ته G. duodenalis giardin alpha-2 ۽ giardin alpha-7.3 NLRP3 inflammasome کي مائوس پرائمري peritoneal macrophages ۾ چالو ڪري ٿو.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin NLRP3 inflammasome کي مائوس جي پيريٽونل ميڪروفيجز ۾ چالو ڪري ٿو.recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin and pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin کي پرائمري murine peritoneal macrophages ۽ سيلز ۾ منتقل ڪريو، يا اظهار جي تجزيي لاءِ 24 ڪلاڪن اندر سپرنيٽنٽ کي فصل ڪريو، اوليگومرائيزيشن ، رطوبت.۽ اهم سوزش واري پروٽين جي مقامي ڪرڻ.PBS-صرف (C) گروپ ۽ pcDNA3.1 (+) اڪيلو علاج گروپ منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو، ۽ GEV علاج گروپ مثبت گروپ طور استعمال ڪيو ويو.هڪ اهم سوزش واري پروٽين NLRP3، بشمول NLRP3، پرو-IL-1β، پرو-ڪيسپيس-1، ۽ پي 20 ڪئسپيس-1، مغربي بلٽنگ ذريعي ڳوليا ويا.b سپرنيٽنٽ ۾ IL-1β جي secretion جي سطح کي اينزيم سان ڳنڍيل امونسوربينٽ پرس (ELISA) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو.ڪنٽرول ۽ تجرباتي گروپن جي وچ ۾ فرق SPSS سافٽ ويئر ورزن 22.0 استعمال ڪندي مختلف قسم جي هڪ طرفي تجزيي (ANOVA) ذريعي تجزيو ڪيو ويو.Asterisks گروپن جي وچ ۾ اهم فرق ظاهر ڪن ٿا **P <0.01 ۽ ***P <0.001.p pellets ۾ ASC oligomerization جي سطح ڊي ايس ايس ڪراس-لنڪنگ تجزيي پاران طئي ڪيا ويا، جڏهن ته ASC جي سطح سيل لائيٽس ۾ لوڊ ڪنٽرول جي طور تي استعمال ڪيا ويا.d immunofluorescence استعمال ڪندي ISC لوڪلائيزيشن جو تصور.e Immunofluorescence استعمال ڪيو ويو NLRP3 جي لوڪلائيزيشن کي ڏسڻ لاءِ.ASC، apoptotic speck-like پروٽين؛IL، interleukin؛NLRP3، nucleotide-binding oligomerization-like receptor 3؛ns، اهم نه آهي (P > 0.05)
ٻئي G. duodenalis ۽ GEVs جيڪي ان کي ڳنڍي ٿو NLRP3 سوزش کي چالو ڪري ٿو ۽ ويٽرو ۾ ميزبان سوزش واري ردعمل کي منظم ڪن ٿا.اهڙيء طرح، G. duodenalis جي pathogenicity ۾ NLRP3 سوزش جو ڪردار اڃا به واضح ناهي.ھن مسئلي جي تحقيق ڪرڻ لاءِ، اسان ھڪ تجربو ٺاھيو آھي چوٿون جي وچ ۾ متاثر ٿيل G. duodenalis cyst ۽ mouse infected with G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor treatment ۽ ان جي مقابلي ۾ NLRP3 inflammasome expression when infected with G. duodenalis cyst.تجربا جو هڪ تفصيلي اسڪيم تصوير 3a ۾ ڏيکاريل آهي.مختلف علاج گروپن ۾ چوٿين جي جسم جي وزن ۾ تبديلين جي نگراني ڪئي وئي 7 ڏينهن تائين سيسٽ جي انفيڪشن کان پوء، ۽ نتيجا تصوير 3b ۾ ڏيکاريا ويا آهن.خالص PBS سان علاج ڪيل گروپ جي مقابلي ۾، نتيجن مان ظاهر ٿيو ته (i) G. duodenalis cyst سان متاثر ٿيل چوڪن جي جسم جو وزن انفيڪشن کان پوء 3 ڏينهن کان 7 ڏينهن تائين گهٽجي ويو؛(ii) MCC950 inhibitor سان علاج جو ڪو خاص اثر ڪونھي جي جسم جي وزن تي..سنگل انفڪشن گروپ جي مقابلي ۾، MCC950 سان علاج ٿيل دوڊينل انفيڪشن گروپ جو BW مختلف درجي تائين گھٽجي ويو (ڏينھن 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; ڏينھن 2: ANOVA, F(3, 24) ) = 0.4602، P <0.0001؛ ڏينهن 3: ANOVA، F(3, 24) = 0.8360، P = 0.0010؛ ڏينهن 4: ANOVA، F(3, 24) = 1.683، P = 0.0052، ANOVA؛ (3، 24) = 0.6497، P = 0.0645؛ ڏينهن 6: ANOVA، F(3, 24) = 5.457، P=0.0175؛ ANOVA، F(3, 24) = 2.893، P = 0.0202).انهن ڊيٽا مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته NLRP3 انفلاماسوم چوٿن کي دوڊينل انفيڪشن جي شروعاتي مرحلن (2-4 ڏينهن) ۾ اهم وزن جي نقصان کان بچائيندو آهي.ان کان پوء اسان جو مقصد اهو معلوم ڪيو ويو آهي ته G. duodenalis trophozoites duodenal lavage fluid ۾ ۽ نتيجا ڏيکاريا ويا آهن شڪل 3c ۾.G. duodenalis cyst انفيڪشن گروپ جي مقابلي ۾، NLRP3 inflammasome (t(12) = 2.902، P = 0.0133) کي بلاڪ ڪرڻ کان پوءِ ڊيوڊينم ۾ ٽرفوزائٽس جو تعداد گهڻو وڌي ويو.HE سان داغ ٿيل دوڊينل ٽشوز ڏيکاريا ويا، منفي ڪنٽرول جي مقابلي ۾ PBS ۽ MCC950 سان علاج ٿيل اڪيلو: (i) G. duodenalis cyst انفيڪشن جي نتيجي ۾ duodenal villi (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) ۽ crypt atrophy (ANOVA، F(3، 24) = 0.4716، P = 0.0089)؛(ii) چوهڙن مان ٻُوڊينم متاثر ٿيل G. duodenalis cysts ۽ MCC950 inhibitors سان علاج ڪيو ويو.دوڊينل ويل خراب ۽ مري ويا (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) atrophy ۽ crypt branching سان (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .انهن نتيجن مان معلوم ٿئي ٿو ته اين ايل آر پي 3 انفلاماسموم G. duodenalis جي pathogenicity کي گهٽائڻ ۾ ڪردار ادا ڪري ٿو.
Giardia duodenum انفيڪشن ۾ NLRP3 سوزش جو ڪردار.چوڪن کي گيو ڪيو ويو (iv) ڊيوڊينوڪوڪل سيسٽ سان ۽ پوء علاج ڪيو ويو MCC950 (ip).PBS يا MCC950 سان اڪيلو علاج جا گروپ ڪنٽرول طور استعمال ڪيا ويا.تجرباتي گروپ ۽ علاج جو طريقو.b مختلف علاج گروپن مان هر هڪ ۾ چوٿين جي جسم جو وزن 7 ڏينهن تائين مانيٽر ڪيو ويو.G. duodenalis انفيڪشن گروپ ۽ G. duodenalis + MCC950 انفيڪشن علاج گروپ جي وچ ۾ فرق SPSS سافٽ ويئر ورزن 22.0 استعمال ڪندي ٽي ٽيسٽ ذريعي تجزيو ڪيو ويو.Asterisks ظاھر ڪن ٿا اهم فرقن تي *P <0.05، **P <0.01، يا ***P <0.001.c Parasitic لوڊ طئي ڪيو ويو ٽريفوزائٽس جي تعداد کي ڳڻڻ جي ذريعي duodenal lavage سيال ۾.G. duodenalis انفيڪشن گروپ ۽ G. duodenalis + MCC950 انفيڪشن علاج گروپ جي وچ ۾ فرق SPSS سافٽ ويئر ورزن 22.0 استعمال ڪندي ٽي ٽيسٽ ذريعي تجزيو ڪيو ويو.Asterisks ظاهر ڪن ٿا اهم اختلافن تي *P <0.05.d Hematoxylin ۽ eosin (H&E) داغدار جا نتيجا دووڊينل هسٽوپيٿولوجي.ڳاڙهي تير ويل کي نقصان ڏيکاري ٿو، سائو تير crypts کي نقصان جي نشاندهي ڪن ٿا.اسڪيل بار: 100 µm.e، f duodenal villus height ۽ mouse crypt height جو شمارياتي تجزيو.Asterisks **P <0.05 ۽ **P <0.01 تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا.نتيجا 7 آزاد حياتياتي تجربن مان ورتا ويا آهن.BW، جسم جو وزن؛ig، intragastric پهچائڻ جو رستو؛ip، intraperitoneal پهچائڻ جو رستو؛ns، اهم نه آهي (P > 0.05)؛PBS، فاسفيٽ بفر ٿيل لوڻ؛WT، جهنگلي قسم
IL-1β جو secretion سوزش چالو ڪرڻ جو هڪ نشان آهي.اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا G. duodenalis alpha-2 giardine ۽ alpha-7.3 giardine vivo ۾ NLRP3 ميزبان سوزش کي چالو ڪري ٿو، اسان استعمال ڪيو اڻ علاج ٿيل WT چوٿون (شام گروپ) ۽ NLRP3 inflammasome-blocked mice (MCC950 inhibited treatment group).تجربي جي تفصيلي اسڪيم تصوير 4a ۾ ڏيکاريل آھي.تجرباتي گروپن ۾ چوٿون شامل آھن جن جو علاج PBS سان ڪيو ويو، G. duodenalis cyst جو علاج gavage، intramuscular injection of pcDNA3.1، ۽ intramuscular injection of pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine or pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.7 هين ڏينهن تي ريٽومبيننٽ پلازميڊ جي intramuscular انتظاميه کان پوء، سيرم گڏ ڪيو ويو ۽ هر گروپ ۾ IL-1β جي سطح مقرر ڪئي وئي.جيئن ته شڪل 4b ۾ ڏيکاريل آهي، MOCK گروپ ۾: (i) PBS گروپ جي مقابلي ۾، pcDNA3.1 علاج IL-1β secretion تي ڪو خاص اثر نه پيو (ANOVA, F(4.29) = 4.062, P = 0.9998)، جڏهن ته، IL-β secretion خاص طور تي G. duodenalis cyst group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002)، (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine ۽ pcDNA3 ۾ وڌي وئي.1- Alpha-7.3 giardine جي intramuscular انجيڪشن خاص طور تي سيرم IL-1β جي سطحن کي وڌايو (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine induced high levels of IL-1β secretion in pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .MCC950 علاج گروپ ۽ MOCK گروپ ۾ هر گروپ جي مقابلي ۾: (i) PBS ڪنٽرول گروپ ۾ IL-1β secretion جي سطح ۽ pcDNA3.1 ڪنٽرول گروپ MCC950 inhibitor کي بلاڪ ڪرڻ کان پوء هڪ خاص حد تائين گهٽجي ويو، پر فرق نه هو. اهم (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949)؛(ii) MCC950 کي بلاڪ ڪرڻ کان پوءِ.G. duodenalis cyst-infected group، pcDNA3.1-alpha-2 giardine group، and pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine گروپ (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3.540 , P = 0.0120؛ pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, ) = 3.540، پي = 0.0164).انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته الفا-2 گارڊائن ۽ الفا-7.3 گارڊائن vivo ۾ NLRP3 سوزش جي چالو ڪرڻ ۾ ثالثي ڪن ٿا.
pcDNA3.1(+)-giardines NLRP3 ميزبان inflammasome کي vivo ۾ چالو ڪري ٿو.چوڪن کي حفاظتي بچاءُ ڪيو ويو (IM) recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine سان ۽ پوءِ MCC950 (ip; MCC950 گروپ) سان علاج ڪيو ويو يا نه (ڊمي گروپ) ).PBS يا pcDNA3.1(+) پلاسمڊ علاج گروپ هڪ منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو، G. duodenalis cyst علاج گروپ هڪ مثبت ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو.تجرباتي گروپ ۽ علاج جو طريقو.b چوٿين ۾ IL-1β جي سيرم جي سطح ماپ ڪئي وئي ڏينهن 7 ​​تي ELISA جي امتحان ذريعي.MOCK گروپ ۾ گروپن جي وچ ۾ فرق ھڪڙي طرفي ANOVA استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو، ۽ MOCK گروپ ۽ MCC950 گروپ جي وچ ۾ SPSS سافٽ ويئر ورزن 22.0 جي ٽي ٽيسٽ استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو.Asterisks MOCK گروپ ۾ علاج گروپن جي وچ ۾ اهم فرق ظاهر ڪن ٿا، *P <0.05 ۽ ***P <0.001؛ڊالر جون نشانيون ($) MOCK گروپ ۾ هر گروپ ۽ P <0.05 تي MCC950 گروپ جي وچ ۾ اهم فرق ظاهر ڪن ٿا.ست آزاد حياتياتي تجربن جا نتيجا.i، intramuscular انجيڪشن، ns، اهم نه آهي (P > 0.05)
الفا-2 ۽ الفا-7.3 giardine-ثالث چالو ڪرڻ جي اثر جي تحقيق ڪرڻ لاءِ NLRP3 ميزبان انفلاماسوم جي G. duodenalis infectivity تي، اسان استعمال ڪيو WT C57BL/6 چوٿون ۽ injected alpha-2 giardine ۽ alpha-7.3 giardine.پلاسميڊ کي 3 ڏينهن کان پوءِ G. duodenalis cyst جي گيسٽرڪ ٽيوب ذريعي، intramuscularly انجيڪشن ڪيو ويو، جنهن کان پوءِ چوٿين 7 ڏينهن تائين مشاهدو ڪيو ويو.تجربي جي تفصيلي اسڪيم تصوير 5a ۾ ڏيکاريل آھي.هر مائوس جي جسم جو وزن هر روز ماپيو ويو، تازو دوڊينل ٽشو جا نمونا گڏ ڪيا ويا 7 هين ڏينهن گيسٽرڪ ٽيوب ذريعي انتظاميه کان پوء، ٽرفوزائٽس جو تعداد ماپ ڪيو ويو، ۽ هسٽوپيٿولوجي تبديلين جو مشاهدو ڪيو ويو.جيئن ته شڪل 5b ۾ ڏيکاريل آهي، فيڊنگ جي وقت وڌائڻ سان، هر گروپ ۾ چوٿين جي BW آهستي آهستي وڌي وئي.G. duodenalis cysts جي intragastric انتظاميه کان پوء ٽئين ڏينهن تي چوٿين جي MT گهٽجڻ شروع ٿي، ۽ پوء آهستي آهستي وڌي وئي.اين ايل آر پي 3 انفلامازوم جي چالو ٿيڻ سان الفا-2 گارڊائن ۽ الفا 7.3 گارڊائن جي انٽرماسڪولر انجيڪشن ذريعي متاثر ٿيل وزن ۾ گھٽتائي خاص طور تي چوٿن ۾ (ڏينهن 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine، ANOVA، F(4, 30) = P1.39 = 0.9754 ڏينهن 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 ڏينهن 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172، P = 0.9979؛ ڏينھن 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; ڏينھن 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, A 4، 30) = 0.8222، P = 0.0262 ڏينهن 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine، ANOVA، F(4 , 30) = 0.8222، P = 0.0083 ڏينھن: pcDNA3.1-alpha-2 , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, ڏينھن 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, ڏينھن 5: pcDNA3.1-alpha - 2 گارڊائن، ANOVA، F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 ڏينهن 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 ڏينھن 6: pcDNA1 alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Day 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;ڏينهن 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 ڏينهن 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).پرازياتي لوڊ جو اندازو لڳايو ويو دوڊينم ۾ (Fig. 5c).غير علاج ٿيل مثبت ڪنٽرول جي مقابلي ۾ ۽ خالي پي سي ڊي اين اي 3.1 ویکٹر سان انجيڪشن ٿيل گروپ، α-2 giardine ۽ α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) سان انجيڪشن ڪيل گروپن ۾ G. duodenalis trophozoites جو تعداد خاص طور تي گھٽجي ويو. -2 گارڊائن: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P <0.0001).ان کان علاوه، giardine alfa-7.3 giardine alfa-2 (ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P = 0.0081) جي ڀيٽ ۾ چوٿين ۾ وڌيڪ حفاظتي هو.HE staining جا نتيجا تصوير ۾ ڏيکاريا ويا آهن.5d-f.alpha-2 giardine ۽ alpha-7.3 giardine سان انجيڪشن لڳل چوهڙن ۾ گهٽ ڊوڊينل ٽشوز جا زخم هئا، جن کي وائلس جي نقصان سان ظاهر ڪيو ويو آهي، ان جي مقابلي ۾ G. duodenalis سان انجيڪشن لڳل چوٿين ۽ G. duodenalis سان انجيڪشن لڳل چوهڙن کي هڪ خالي pcDNA3 ویکٹر .1 Zoom سان.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 or P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, = 0.0028 يا P = 0.0055) ۽ گھٽيل ڪرپٽ ايٽروفي (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 or P = 0.0158؛ pcDNA3.1-alpha-2 giardine ، F(3، 24) = 1.470، P = 0.0371 يا P = 0.0191).انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته الفا-2 گارڊائن ۽ الفا-7,3 گارڊائن ويوو ۾ NLRP3 سوزش کي چالو ڪندي G. duodenalis جي انفيڪشن کي گھٽائي ٿو.
G. duodenalis انفيڪشن ۾ pcDNA3.1(+)-giardins جو ڪردار.چوهڙن کي بچاءُ (IM) recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine or pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine سان ڪيو ويو ۽ پوءِ G. duodenalis cysts (ig) سان چيلينج ڪيو ويو.PBS گروپ ۽ pcDNA3.1 (+) + دوڊينل سيسٽ علاج گروپ منفي ڪنٽرول گروپ طور استعمال ڪيو ويو، ۽ دوڊينل سيسٽ علاج گروپ مثبت ڪنٽرول گروپ طور استعمال ڪيو ويو.تجرباتي گروپ ۽ علاج جو طريقو.b هر هڪ مختلف علاج گروپن ۾ چوٿين جي ايم ٽي جي نگراني ڪئي وئي 7 ڏينهن کان پوء چئلينج لاء.Asterisks G. duodenalis گروپ ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine گروپ، *P <0.05، **P <0.01، ۽ ***P <0.001;ڊالر جي نشاني ($) ظاهر ڪري ٿي هڪ اهم فرق G. duodenalis جي هر گروپ ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جارڊين گروپ، $$P<0.01 ۽ $$$P<0.001.c Parasitic لوڊ طئي ڪيو ويو 1 ml duodenal lavage ۾ trophozoites جي تعداد کي ڳڻڻ جي ذريعي دوڊينم (3 سينٽي ڊگهو) ۽ ظاهر ڪيو ويو ته پرازي جي تعداد في سينٽي ڊيوڊنم جي.G. duodenalis انفيڪشن گروپ، pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine گروپ، ۽ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine گروپ جي وچ ۾ فرق SPSS سافٽ ويئر ورزن 22.0 استعمال ڪندي هڪ طرفي ANOVA ذريعي تجزيو ڪيو ويو.Asterisks **P <0.01 ۽ ***P <0.001 تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا.دوڊينم ۾ هسٽوپيٿولوجي تبديليون.ڳاڙهي تير ويل کي نقصان ڏيکاري ٿو، سائو تير crypts کي نقصان جي نشاندهي ڪن ٿا.اسڪيل بار: 100 µm.e، f ماؤس جي دوڊينل ويلس جي اوچائي (اي) ۽ ڪرپٽ جي اوچائي (f) جو شمارياتي تجزيو.شڪل 1d ۾ گروپن جي وچ ۾ فرق SPSS سافٽ ويئر ورزن 22.0 استعمال ڪندي ھڪڙي طرفي ANOVA ذريعي تجزيو ڪيو ويو.Asterisks **P <0.05 ۽ **P <0.01 تي اهم فرق ظاهر ڪن ٿا.ست آزاد حياتياتي تجربن جا نتيجا.ns، اهم نه آهي (P > 0.05)
Giardia duodenum انسانن ۽ ٻين ٿلهي جانورن جو هڪ مشهور آنٽي پرجيز آهي جيڪو giardiasis جو سبب بڻجندو آهي.2004 ۾، ان کي WHO جي نظرانداز ٿيل بيمارين جي شروعات ۾ شامل ڪيو ويو ڇاڪاڻ ته ان جي 6 سالن کان وڌيڪ پکڙجڻ جي ڪري، خاص طور تي گھٽ سماجي اقتصادي حيثيت وارن برادرين ۾ [32].پيدائشي مدافعتي نظام G. duodenalis انفيڪشن جي مدافعتي ردعمل ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو.ماؤس جي ميڪروفيجز کي ٻڌايو ويو آهي ته اهي G. duodenalis کي ڳنڍي ڇڏيندا آهن ۽ خارج ڪري ڇڏيندا آهن [33].اسان جي پوئين اڀياس ڏيکاريا آهن ته G. duodenalis، هڪ غير ناگوار extracellular parasite، فعال ڪري ٿو p38 MAPK، ERK، NF-κB p65، ۽ NLRP3 inflammatory signaling pathways in mous macrophages کي منظم ڪرڻ لاءِ ميزبان سوزش واري ردعمل کي منظم ڪرڻ لاءِ، ۽ جاري ڪيل GEV شايد ان عمل کي وڌائي سگھي ٿي.13]، 24].بهرحال، GEV ۾ NLRP3 سوزش واري ضابطي واري سوزش ۾ شامل صحيح PAMPs ۽ giardiasis ۾ NLRP3 سوزش جي ڪردار کي واضح ڪيو وڃي ٿو.انهن ٻن سوالن تي روشني وجهڻ لاءِ، اسان هي مطالعو ڪيو.
NLRP3 inflammasome مدافعتي خاني جي cytoplasm ۾ واقع آهي ۽ مختلف ذرات جهڙوڪ يورڪ ايسڊ ڪرسٽل، زهر، بيڪٽيريا، وائرس ۽ پرجيز ذريعي چالو ٿي سگهي ٿو.بيڪٽيريا جي مطالعي ۾، زهر جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي اهم PAMPs جيڪي سوزش واري سينسر کي چالو ڪن ٿا، ان جي نتيجي ۾ سوزش ۽ سيل جي موت [34].ڪجھ ساختياتي طور تي متنوع زهر، جهڙوڪ هيمولسين مان اسٽيفيلوڪوڪوس اوريس [35] ۽ ايسچريچيا ڪولي [36]، هيمولسين BL (HBL) انٽروٽڪسين (NHE) [37]، NLRP3 جي سوزش کي چالو ڪري ٿو.وائرل اڀياس ڏيکاريا آهن ته وائرلينس پروٽينس جهڙوڪ SARS-COV-2 لفافي (E) پروٽين [38] ۽ Zika وائرس NS5 پروٽين [39] اهم PAMPs آهن جن کي NLRP3 ريڪٽر پاران تسليم ڪيو ويو آهي.پرازي جي مطالعي ۾، ڪيترن ئي پرجيز کي ميزبان سوزش جي چالو ڪرڻ سان لاڳاپيل ٻڌايو ويو آهي، جهڙوڪ Toxoplasma gondii، Trichomonas vaginalis [40]، Trypanosoma cruzi [41]، ۽ Leishmania [42].ڊانس گرينول پروٽينس GRA35، GRA42، ۽ GRA43، Toxoplasma gondii جي وائرس سان جڙيل آهن، ليوس rat macrophages ۾ pyroptosis جي شموليت لاء گهربل آهن [43].ان کان سواء، ڪجهه لشمانيا مطالعي تي ڌيان ڏنو ويو آهي انفرادي انوولز ۾ شامل آهن NLRP3 inflammasome ۾ شامل آهن، جهڙوڪ پارسائيٽ جھلي lipophosphoglycan [44] يا زنڪ ميٽيلوپروٽيز [45].annexin-like alpha-giardin خاندان جي جين مان، الفا-1 giardin هڪ امڪاني ويڪسين اميدوار طور ڏيکاريو ويو آهي جيڪو ماؤس ماڊل ۾ G. duodenalis جي خلاف تحفظ فراهم ڪري ٿو [18].اسان جي مطالعي ۾، اسان چونڊيو G. duodenalis virulence factors alpha-2 ۽ alpha-7,3 giardines، جيڪي giardia لاءِ منفرد آھن پر نسبتاً گھٽ رپورٽ ٿيل آھن.انهن ٻن ٽارگيٽ جينز کي ڪلون ڪيو ويو pcDNA3.1(+) eukaryotic ايڪسپريشن سسٽم ویکٹر ۾ سوزش چالو ڪرڻ جي تجزيي لاءِ.
اسان جي ماؤس جي ماڊل ۾، ڪليو ٿيل ڪئسپيس ٽڪرا سوزش واري چالو جي نشانن جي طور تي ڪم ڪن ٿا.حوصلا افزائي تي، NLRP3 ASC سان رابطو ڪري ٿو، پروڪاسپسس کي ڀرتي ڪري ٿو، ۽ فعال ڪيسپيسس پيدا ڪري ٿو جيڪي پرو-IL-1β ۽ پرو-IL-18 کي بالترتيب IL-1β ۽ IL-18، بالترتيب -18 ۾ صاف ڪن ٿا.Inflammatory caspases (caspases-1, -4, -5 and -11) سيسٽين پروٽيز جو هڪ محفوظ خاندان آهن جيڪي فطري دفاع لاءِ نازڪ آهن ۽ سوزش ۽ پروگرام ٿيل سيل جي موت ۾ ملوث آهن [46].Caspase-1 Canonical inflammasomes [47] پاران چالو ڪيو ويندو آهي، جڏهن ته ڪيسپيس-4، -5، ۽ -11 atypical inflammasomes جي ٺهڻ دوران cleaved آهن [48].هن مطالعي ۾، اسان ماؤس پيريٽونيل ميڪروفيجز کي ماڊل طور استعمال ڪيو ۽ تحقيق ڪئي p20 caspase-1 cleaved caspase-1 هڪ مارڪر جي طور تي ميزبان NLRP3 سوزش چالو ڪرڻ جي مطالعي ۾ G. duodenalis انفيڪشن.نتيجن مان ظاهر ٿيو ته ڪيتريون ئي الفا-گيارڊين سوزش جي عام چالو ڪرڻ جا ذميوار آهن، جيڪي بيڪٽيريا ۽ وائرس ۾ شامل اهم وائرلينس ماليڪيولز جي دريافت سان مطابقت رکن ٿا.تنهن هوندي، اسان جو مطالعو صرف هڪ ابتدائي اسڪرين آهي ۽ ٻيا انوول آهن جيڪي غير ڪلاسيڪل سوزش کي چالو ڪري سگھن ٿا، جيئن اسان جي پوئين مطالعي کي G. duodenalis انفيڪشن ۾ ٻنهي ڪلاسيڪل ۽ غير ڪلاسيڪل سوزش مليا آهن [13].وڌيڪ اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا پيدا ٿيل p20 caspase-1 NLRP3 inflammasome سان جڙيل آهي، اسان alpha-2 ۽ alpha-7.3 giardins کي ماؤس peritoneal macrophages ۾ تبديل ڪيو ته جيئن اهم ماليڪيول پروٽين جي اظهار جي سطح ۽ ASC oligomerization جي سطحن کي طئي ڪري، تصديق ڪري ته ٻئي α-giardins چالو ٿين ٿا. سوزش واري NLRP3.اسان جا نتيجا منڪو-پريخودا وغيره جي نتيجن کان ٿورو مختلف آهن، جن ٻڌايو ته Caco-2 سيلز جي محرک G. muris يا E. coli EPEC strains سان اڪيلو NLRP3، ASC، ۽ caspase-1 جي فلوروسنس شدت کي وڌائي سگھي ٿو، جيتوڻيڪ خاص طور تي نه، جڏهن ته G. muris ۽ E. coli جي قيمت ڪيئن ٽن پروٽينن جي سطح کي وڌايو [49].هي تفاوت شايد Giardia جي نسلن، سيل لائنن، ۽ پرائمري سيلز جي چونڊ ۾ اختلافن جي ڪري ٿي سگھي ٿو.اسان 5-هفتي واري عورت WT C57BL/6 چوٿين ۾ MCC950 استعمال ڪندي vivo assays ۾ پڻ پرفارم ڪيو، جيڪي G. duodenalis لاءِ وڌيڪ حساس هوندا آهن.MCC950 هڪ طاقتور ۽ چونڊيل ننڍڙو ماليڪيول NLRP3 انابيٽر آهي جيڪو نانومولر ڪنسنٽريشن تي غير قانوني ۽ غير قانوني NLRP3 چالو ڪرڻ کي روڪي ٿو.MCC950 NLRP3 چالو کي روڪي ٿو پر AIM2، NLRC4، ۽ NLRP1 جي سوزش واري رستا يا TLR سگنلنگ رستن جي چالو ڪرڻ تي اثر انداز نٿو ڪري [27].MCC950 NLRP3 ايڪٽيويشن کي روڪي ٿو پر NLRP3 جي شروعات، K+ efflux، Ca2+ آمد، يا NLRP3 ۽ ASC جي وچ ۾ رابطي کي روڪي نٿو سگهي.ان جي بدران، اهو ASC oligomerization کي بلاڪ ڪندي NLRP3 سوزش واري چالو کي روڪي ٿو [27].تنهن ڪري، اسان ايم سي سي 950 استعمال ڪيو هڪ وييو مطالعي ۾ اين ايل آر پي 3 انفلاماسووم جي ڪردار کي طئي ڪرڻ لاء giardine انجڻ کان پوء.چالو ٿيل ڪئسپيس-1 p10 پرو-آفلامٽري سيٽوڪائنز پرو-IL-1β ۽ پرو-IL-18 کي بالغ IL-1β ۽ IL-18 [50] ۾ صاف ڪري ٿو.هن مطالعي ۾، سيرم IL-1β سطح giardine-علاج ٿيل چوٿين ۾ MCC950 سان يا ان کان سواء استعمال ڪيا ويا ته ڇا اين ايل آر پي 3 سوزش چالو ڪيو ويو آهي.جيئن توقع ڪئي وئي، MCC950 علاج خاص طور تي سيرم IL-1β جي سطح کي گھٽائي ڇڏيو.اهي ڊيٽا واضح طور تي ظاهر ڪن ٿا ته G. duodenalis giardin alfa-2 ۽ giardin alfa-7.3 NLRP3 ماؤس جي سوزش کي چالو ڪرڻ جي قابل آهن.
گذريل ڏهاڪي ۾ گڏ ڪيل اهم ڊيٽا اهو ظاهر ڪيو آهي ته IL-17A G. muris جي خلاف مدافعت جو ماسٽر ريگيوليٽر آهي، IL-17RA سگنلنگ، پيدا ڪرڻ antimicrobial peptides، ۽ ضابطي جي ضابطي واري ڪارڪردگي [51].جڏهن ته، Giardia انفيڪشن نوجوان بالغن ۾ گهڻو ڪري ٿيندي آهي، ۽ اهو ٻڌايو ويو آهي ته نوجوان چوٿين ۾ Giardia انفيڪشن IL-17A ردعمل کي چالو نه ڪندو آهي ان جي حفاظتي اثر کي وڌائڻ لاء [52]، تحقيق ڪندڙن کي ٻين امونومودوليٽري گيارڊيا کي ڳولڻ لاء زور ڏنو.helminth انفيڪشن جي ميڪانيزم.هڪ تازي مطالعي جي مصنفن ٻڌايو آهي ته G. muris E. coli EPEC ذريعي NLRP3 سوزش کي چالو ڪري سگهي ٿو، جيڪو antimicrobial peptides جي پيداوار کي وڌائيندو آهي ۽ ان جي منسلڪ صلاحيت کي گھٽائي ٿو ۽ آنت جي رستي ۾ trophozoites جو تعداد، ان سان کولن جي شدت کي گھٽائي ٿو. بيڪيلي جي ڪري بيماريون [49].NLRP3 سوزش مختلف بيمارين جي ترقي ۾ ملوث آهي.اڀياس ڏيکاريا آهن ته Pseudomonas aeruginosa سيل جي موت کان بچڻ لاء ميڪروفيجز ۾ آٽوفيگي کي متحرڪ ڪري ٿو، ۽ اهو عمل NLRP3 inflammasome جي فعال ٿيڻ تي منحصر آهي [53].N. caninum لاء، رد عمل آڪسيجن نسلن جي وچولي چالو NLRP3 inflammasome جي ميزبان ۾ ان جي نقل کي محدود ڪري ٿي، ان کي هڪ امڪاني علاج جو مقصد بڻائي ٿو [9].Paracoccidioides brasiliensis مليا آهن NLRP3 inflammasome جي چالو ڪرڻ لاءِ مائوس بون ميرو مان نڪتل ڊينڊريٽڪ سيلز ۾، جنهن جي نتيجي ۾ سوزش واري سائٽوڪائن IL-1β کي آزاد ڪيو وڃي ٿو، جيڪو ميزبان دفاع ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو [10].لشمانيا جون ڪيتريون ئي نسلون، جن ۾ L. amazonensis، L. major، L. braziliensis ۽ L. infantum chagasi شامل آهن، NLRP3 ۽ ASC-dependent caspase-1 کي macrophages ۾ چالو ڪن ٿا، ان سان گڏ Leishmania انفيڪشن.NLRP3 / ASC / caspase-1 جين ۾ چوٿين جي گھٽتائي ۾ پرجيز جي نقل کي وڌايو ويو آهي [11].Zamboni et al.لشمانيا جي انفيڪشن کي ٻڌايو ويو آهي ته اين ايل آر پي 3 انفلاماسوم کي ميڪروفيجز ۾ چالو ڪرڻ جو سبب بڻائيندو آهي، جيڪو انٽرا سيلولر پارسائٽ جي نقل کي محدود ڪري ٿو.اهڙيء طرح، لشمانيا NLRP3 چالو کي روڪڻ واري حڪمت عملي جي طور تي روڪي سگھي ٿو.vivo مطالعي ۾، NLRP3 inflammasome لشمانيا جي خاتمي ۾ مدد ڪئي، پر بافتن کي متاثر نه ڪيو [54].برعڪس، helminthiasis مطالعي ۾، NLRP3 inflammasome جي چالو ڪيو ويو ميزبان جي حفاظتي مدافعتي کي دٻايو گيسٽرو انٽيسٽينل helminthiasis جي خلاف [12].شگيلا هڪ مکيه بيڪٽيريا آهي جيڪو سڄي دنيا ۾ دستن جو سبب بڻجندو آهي.اهي بيڪٽيريا IL-1β جي پيداوار کي P2X7 ريسپيٽر-ثالث K+ efflux، رد عمل آڪسيجن جي نسلن، lysosomal تيزابيت، ۽ mitochondrial نقصان جي ذريعي پيدا ڪري سگھن ٿا.NLRP3 inflammasome منفي طور تي شيگيلا جي خلاف phagocytosis ۽ macrophages جي bactericidal سرگرمي کي منظم ڪري ٿو [55].پلازموڊيم جي مطالعي مان اهو ظاهر ڪيو ويو آهي ته AIM2، NLRP3 يا ڪئسپيس-1 جي گھٽتائي وارا چوٿون پلازموڊيم سان متاثر ٿيل آهن قسم 1 انٽرفيرون جي اعلي سطح پيدا ڪن ٿا ۽ پلازموڊيم انفيڪشن جي خلاف وڌيڪ مزاحمتي آهن [56].جڏهن ته، الفا-2 گارڊائن ۽ الفا-7.3 گارڊائن جو ڪردار چوٿين ۾ NLRP3 سوزش جي روگجنڪ چالو ڪرڻ ۾ واضح ناهي.
هن مطالعي ۾، MCC950 پاران NLRP3 سوزش جي روڪٿام BW کي گھٽائي ڇڏيو ۽ چوٿين ۾ آنت جي lavage سيال ۾ trophozoites جو تعداد وڌايو، جنهن جي نتيجي ۾ دوڊينل ٽائيس ۾ وڌيڪ سخت پيٽولوجي تبديليون.Alpha-2 giardine ۽ alpha-7.3 giardine ميزبان ماؤس NLRP3 جي سوزش کي چالو ڪري ٿو، ماؤس جي جسم جو وزن وڌائي ٿو، آنت جي لوڻ واري فلوئڊ ۾ ٽرفوزائٽس جو تعداد گھٽائي ٿو، ۽ پيٽولوجيڪل ڊيوڊينل زخمن کي گھٽائي ٿو.انهن نتيجن مان معلوم ٿئي ٿو ته G. duodenalis NLRP3 ميزبان سوزش کي الفا-2 giardine ۽ alpha-7,3 giardine ذريعي چالو ڪري سگھي ٿو، چوٿين ۾ G. duodenalis جي pathogenicity کي گھٽائي ٿو.
مجموعي طور تي، اسان جا نتيجا ظاھر ڪن ٿا ته الفا-2 ۽ الفا-7.3 گارڊائنز NLRP3 ھوسٽ انفلاماسوم کي چالو ڪري ٿو ۽ چوٿون ۾ G. duodenalis جي انفيڪشن کي گھٽائي ٿو.تنهن ڪري، اهي انوول giardiasis جي روڪٿام لاء واعدو هدف آهن.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS، Liang AAM، Huang AHC، Sergi KM، Kam JKM.Giardiasis: هڪ جائزو.اهو تازو ظاهر ڪيو ويو آهي ته پيٽ انفلام دوائن کان الرجڪ آهي.2019؛ 13: 134-43.
Escobedo AA، Tsimerman S. Giardiasis: pharmacotherapy جو جائزو.هڪ فارماسسٽ جي ماهر راءِ.2007؛8: 1885-902.
تيان هوفينگ، چن بن، وان جيانفينگ.Giardiasis، دوا جي مزاحمت ۽ نئين مقصدن جي دريافت.دوا جي مقصدن کي خراب ڪري ٿو.2010؛ 10:295-302.
Wang Z، Zhang X، Xiao Yi، Zhang W، Wu X، Qin T، وغيره NLRP3 سوزش ۽ سوزش واري بيماريون.آڪسائيڊ ميڊ سيل لانگيف.2020؛ 2020: 4063562.
چن GY، Núñez G. آنت جي سوزش ۽ ڪينسر ۾ سوزش جو ڪردار.گيسٽرو اينٽرولوجي.2011;141:1986-99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical and atypical NLRP3 inflammasome activation at the crossroads of immune tolerance and gut inflammation.اڳ ۾ مدافعتي.2017؛ 8:36.
لي ايل، وانگ ايڪس سي، گونگ پي ٽي، ژانگ اين، ژانگ ايڪس، لي ايس، وغيره.ROS-ثالث NLRP3 سوزش واري چالو N. caninum انفيڪشن جي جواب ۾ شامل آهي.پرازي ويڪٽر.2020؛ 13:449.